顯色是
ELISA檢測(cè)試劑盒中的后一步溫育反應(yīng),此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行,時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制,有時(shí)可根據(jù)陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色狀況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時(shí)間及時(shí)判斷。
ELISA檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)中顯色十分重要，當(dāng)ELISA沒有顯色，可能原因有這幾個(gè)方面：
1.包被原：包括你的包被液有無問題，有沒有配錯(cuò)。包被原一般加100微升，37度2小時(shí)；
2.封閉：封閉液用的是否適合？你說做了幾次都沒顯色，空白孔也不顯嗎？如果空白也無顏 色，那封閉就沒有問題。一般封閉是200微升每孔，也可以滿孔封閉
3.一抗：檢查你的一抗是否失效。是否是在37度反應(yīng)
4.二抗：底物，底物緩沖液……這些都要好好檢查！
5.洗滌：用PBST洗滌，包被和封閉時(shí)洗板3次；一抗二抗洗滌5次，每次間隔3分鐘。手工和機(jī)器洗滌沒什么不同，就是省力一些。洗5次不會(huì)有負(fù)影響，在一抗和二抗洗滌過程中，恰恰需要多洗幾次，這樣有助于減少非特異性吸附。
避免顯色淡靈敏度低，需注意以下幾點(diǎn)：
1、 常規(guī)ELISA試劑盒平衡至30min；
2、 檢測(cè)抗體、偶聯(lián)HRP請(qǐng)按說明書稀釋比；
3、 樣本、抗體孵育條件(溫度、轉(zhuǎn)速)，請(qǐng)根據(jù)說明書；
4、 控制TMB底物顯色時(shí)間。
