取適量未變性的總蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒(G2026-200T；G2026-1000T)測(cè)蛋白濃度，蛋白濃度測(cè)定過(guò)程如下：
1.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液
取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA)蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中，將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長(zhǎng)期保存。
2.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液
取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。注意稀釋時(shí)按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準(zhǔn)確。
3.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）
將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補(bǔ)足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。
4.準(zhǔn)備待測(cè)樣品
將待測(cè)的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋(可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，確保檢測(cè)結(jié)果可信)，按照每個(gè)樣品20 μL的量加到96孔板中。待測(cè)樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋。
5.配制BCA顯色工作液
將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內(nèi)使用。每個(gè)待測(cè)樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費(fèi)。
6.檢測(cè)
向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測(cè)樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻(可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s)，37℃反應(yīng)30 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)做參比，在562 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄各孔吸光度值。(注：也可以在室溫反應(yīng)2 h，或60℃反應(yīng)30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應(yīng))
7.計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測(cè)樣品的蛋白濃度(μg/mL)，再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測(cè)樣品實(shí)際蛋白濃度。
